做定点突变PCR时,定点突变技术可以引入新的酶切位点（1）基因工程中常使用的载体有质粒、λ噬菌体（的衍生物）和动植物病毒．（2）在定点突变的过程中，需用含有突变位点的人工DNA片段作为引物，引导子链合成．PCR过程中还需要原料（脱氧核苷酸）、模板（DNA链）、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）等条件．（3）甲基化酶DpnI可以选择性降解质粒模板，说明该酶具有专一性或特异性性．（4）①定点突变技术可以用于研究某些氨基酸残基对蛋白质结构的影响，①正确；③定点突变技术可以用于修饰基因表达载体，③正确；④定点突变技术可以用于给基因表达载体引入新的酶切位点，④正确．（5）若要将含有突变位点的质粒导入大肠杆菌中，首先需要用Ca2 处理大肠杆菌细胞使其处于感受态，然后将质粒溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定温度下促使其转化．故答案为：（1）λ噬菌体（的衍生物）动植物病毒（2）引物原料耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）（3）专一性或特异性（4）①②③④（5）Ca2 缓冲液。

寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家M·史密斯（MichaelSmith，1932）发明的。其基本原理如下：应用寡聚核苷酸进行DNA的定点诱变时，首先要把含有待突变的DNA片断段克隆到MI3噬菌体载体中，MI3噬菌体的正链可以感染具有纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌体。

受MI3噬菌体感染的细菌长生速度减慢，在细菌培养皿上会形成透明的噬菌斑。将目的DNA插入到复制型MI3的多克隆位点上，去转染细菌，提取单链DNA作为突变的模板。根据需要设计并合成带有突变核苷酸序列的寡聚核苷酸引物，使与带有目的DNA的单链MI3模板杂交，然后加入DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸，使杂交上的突变引物延伸，并用DNA连接酶使新合成的DNA成环状，再去转染细菌。

如果的模板过量的话，到时候检测的结果就会改过的和没改过的同时存在改过后你所要的基因和改过前的模板基因，因为这两种情况在转化时都能长菌，PCR检测也都一样，只是在测序时才能发现有没有改。这样每次都是测序才发现，显然浪费很多宝贵的时间，所以选择合适的浓度很重要。才多加了50ng，没问题的，本来这浓度也是一个大致的数，我pcr做的多了，基本都是靠感觉加模板量的。

模板多加，最大的影响就是DpnI消解模板的时候容易消解不完全，这个可以从阴性对照的平板上涨了多少菌落看出来，（阴性对照就是可实验组加同样多的模板，以及buffer和酶等等，只是不加引物，最好一起PCR，一起DpnI消解，一起转化）。最佳的肯定是阴性的板子一个都没长，也就说明你实验组的板子上长出来的全部是突变成功的，如果消解不完全，就看阴性的平板上菌落多不多(模板是超螺旋质粒，突变的质粒是带缺刻的，转化效率不及超螺旋状态的质粒)，要是相比你实验组板子上菌落数微不足道，那也没关系，挑两个去测序，运气没那么背。

比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。A的序列为5atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc3，B的序列为5atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg3。首先我们要设计引物，假设引物的序列为：A1:5ATGCATGCTAGCTAGAACGCT3A2:5ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt3B1:5acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc3B2:5cgttttaaaaaattatcccct3我们的目的是将基因A,

（1）基因工程中常使用的载体有质粒、λ噬菌体（的衍生物）和动植物病毒．（2）在定点突变的过程中，需用含有突变位点的人工DNA片段作为引物，引导子链合成．PCR过程中还需要原料（脱氧核苷酸）、模板（DNA链）、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）等条件．（3）甲基化酶DpnI可以选择性降解质粒模板，说明该酶具有专一性或特异性性．（4）①定点突变技术可以用于研究某些氨基酸残基对蛋白质结构的影响，①正确；

③定点突变技术可以用于修饰基因表达载体，③正确；④定点突变技术可以用于给基因表达载体引入新的酶切位点，④正确．（5）若要将含有突变位点的质粒导入大肠杆菌中，首先需要用Ca2 处理大肠杆菌细胞使其处于感受态，然后将质粒溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定温度下促使其转化．故答案为：（1）λ噬菌体（的衍生物）动植物病毒（2）引物原料耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）（3）专一性或特异性（4）①②③④（5）Ca2 缓冲液。